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大腸桿菌雜交

閱讀次數(shù):1242   發(fā)布時間:2012/10/9 10:36:21

一、實(shí)驗(yàn)原理
Lederberg和Tatum(1946)選用典型的大腸桿菌為材料,篩選營養(yǎng)缺陷型。利用雙重和三重缺陷型的菌株,在簡單的合成培養(yǎng)基上混合培養(yǎng),在此培養(yǎng)基上只有重組子能長,親本不能長,即所謂選擇性培養(yǎng),使細(xì)菌雜交獲得成功。圖12-1說明了細(xì)菌的基因重組是不同基因型的細(xì)菌經(jīng)接觸,接合后隨之發(fā)生交換和雜種細(xì)菌分離的過程。
大腸桿菌的雜交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些菌株經(jīng)混合培養(yǎng)能得到重組子,有些卻不能。1952年Hayes做了一個實(shí)驗(yàn),他所用的二個菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素;菌株B是蘇氨酸、亮氨酸和維生素B1的三重缺陷型。Hayes首先篩選鏈霉素抗性突變型ASr和BSr,然后在不含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行正反雜交,結(jié)果沒有不同,但在含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行正反雜交,結(jié)果卻不一樣,在ASs×BSr雜交中能得到重組子,可是ASr×BSs雜交中卻并不出現(xiàn)重組菌落。這一現(xiàn)象說明大腸桿菌中有不同的“性”,它與致育因子F有關(guān)。同時按細(xì)胞中有無F因子將大腸桿菌分為二類,有F因子的為F+,沒有F因子為F-。F因子是一個小的DNA環(huán)狀分子,分子量約4.5×106道爾頓。帶有F因子的細(xì)胞,表面有一種稱為性菌毛的毛狀突起,長約1至20μ。性菌毛上有雄性專一噬菌體(MS2、k17、f2、Qβ等)的吸附位點(diǎn),又和細(xì)胞的接合有關(guān)。F因子在細(xì)胞中能以二種狀態(tài)存在;游離狀態(tài)和整合到寄主染色體的一定位置。以致帶有F因子的大腸桿菌可分為二類:F+和Hfr菌株。經(jīng)吖啶橙處理F+變?yōu)镕-,而Hfr性質(zhì)不變,說明F因子在F+菌株中呈游離狀態(tài),而在Hfr菌株中則整合到寄主染色體的一定位置(圖12-2)。
大腸桿菌雜交在F+與F-菌株之間進(jìn)行,通過細(xì)胞的暫時溝通,形成局部合子。在部分合子的形成中,提供部分染色體或少數(shù)基因的菌稱為供體菌,提供整個染色體的菌稱為受體菌;所以F+和Hfr是供體細(xì)菌,F(xiàn)-是受體菌。F+和F-能雜交,Hfr和F-也能雜交,F(xiàn)-和F-則不能雜交;但這二個可雜交組合其特性不同,主要表現(xiàn)在:1.Hfr細(xì)菌和F-細(xì)菌雜交以后F-細(xì)菌性質(zhì)不變,F(xiàn)+和F-細(xì)菌雜交以后F-細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)镕+(約70%)。2.F+和F-細(xì)菌雜交重組頻率10-6,Hfr和F-細(xì)菌雜交重組頻率高出F+菌株幾百倍,稱高頻重組。
在F+與F-雜交中,F(xiàn)因子由F+供體高頻轉(zhuǎn)移到F-受體,低頻轉(zhuǎn)移宿主染色體的標(biāo)志。原因是F+群體中每個細(xì)胞能轉(zhuǎn)移性因子到F-受體,只有小部分細(xì)胞能轉(zhuǎn)移染色體的標(biāo)記。在Hfr與F-雜交中,Hfr供體的染色體由原點(diǎn)(在F因子內(nèi))開始轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體菌,在這過程中F因子被割裂,F(xiàn)因子基因,一些是首入,另一些是*后進(jìn)入。在這類雜交中只有當(dāng)交配過程長到足以允許整個供體染色體被轉(zhuǎn)移入F-受體,受體細(xì)胞才能由F-變?yōu)镠fr。
雜交實(shí)驗(yàn)有多種不同方法,這里介紹的是直接混合培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。直接混合培養(yǎng)法操作簡單,適用于確定二個菌株間能否雜交或測定重組頻率的高低,而液體培養(yǎng)適宜于細(xì)菌的基因定位。
二、實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌(EscherichiacoliK12)的四個菌株:K12Pro(λ)F+;W1485HisIleF+;W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr(λ)F-;HfrCMetTrp。
Pro:脯氨酸,(λ):原噬菌體整合在染色體上,His:組氨酸,ilv:異亮氨酸纈氨酸,Thr:蘇氨酸,Leu:亮氨酸,thi:維生素B1,xyl:木糖,Gal:半乳糖,ara:阿拉伯糖,mtl:甘露醇,mal:麥芽糖,lac:乳糖,strr:鏈霉素抗性,Met:甲硫氨酸,Trp:色氨酸。
三、實(shí)驗(yàn)器具和藥品
1.用具:滅菌培養(yǎng)皿(9厘米),滅菌三角瓶(150毫升),滅菌吸管(1、5、10毫升),滅菌離心管,滅菌空試管。
2.培養(yǎng)基:
(1)基本培養(yǎng)基Vogel50×*:MgSO4·7H2O10克,檸檬酸100克,NaNH4HPO4·4H2O175克,K2HPO4500克(K2HPO4·3H2O644克),蒸餾水約1,000毫升**(配好后放入冰箱保存?zhèn)溆茫?/font>
(2)平板用基本培養(yǎng)基:Vogel50×2毫升,葡萄糖2克,瓊脂2克***,蒸餾水98毫升,pH7.0,高壓滅菌8磅/英寸230分鐘。
(3)液體完全培養(yǎng)基(肉湯培養(yǎng)基):牛肉膏0.5克,蛋白胨1克,NaCl0.5克,蒸餾水100毫升,pH7.2,高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
(4)半固體培養(yǎng)基:瓊脂0.7—1克,蒸餾水100毫升,pH7.0,高壓滅菌15磅/英寸215分鐘。
四、實(shí)驗(yàn)說明
大腸桿菌中除了不同型細(xì)胞的接合外,同型細(xì)胞F+與F+*即濃度為使用濃度的50倍。
**將稱好的藥品分別溶解于670毫升蒸餾水中,待一種藥品溶解后再放另一種藥品,直至全部藥品都溶解,然后加水定容到1.000毫升。
***瓊脂的添加量由1.5—2克,根據(jù)瓊脂的質(zhì)量而定。凝固性能好的瓊脂,可少加一些,反之,則要多加一些。Hfr與Hfr也能接合,但重組頻率很低。細(xì)胞中的F因子使細(xì)胞壁的抗原發(fā)生了變化,這些不同于F性菌毛的表面成分阻止了F+與F+細(xì)胞雜交。經(jīng)培養(yǎng)后處于饑餓條件下的F+細(xì)胞喪失了它們的表面排斥性,才能與其它F+細(xì)胞接合(這種改變是暫時的,一旦在新鮮培養(yǎng)基中,繼續(xù)生長正常的表面特性又恢復(fù)),這些表型上的“F-細(xì)胞”稱為擬表型。在抑制新的F性菌毛和表面成分形成的條件下生長,如低溫下連續(xù)通氣培養(yǎng)24—48小時,能增加擬表型的百分?jǐn)?shù)。
1946年Lederberg和Tatum開始發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的接合以后,普遍認(rèn)為DNA的轉(zhuǎn)移必需F+(Hfr)與F-細(xì)胞的緊密接觸。Anderson等于1957年根據(jù)電鏡照片指出接合細(xì)胞之間形成了橋。之后發(fā)現(xiàn)F+(Hfr)和性菌毛之間的關(guān)系,認(rèn)為細(xì)菌染色體和專一雄性噬菌體通過性菌毛而轉(zhuǎn)移。近來的電鏡照片已經(jīng)發(fā)現(xiàn)接合細(xì)胞通過性菌毛接觸,并有實(shí)驗(yàn)依據(jù)。細(xì)胞接合后,供體中的DNA開始合成。一個單鏈DNA轉(zhuǎn)移入受體并合成一條新的互補(bǔ)鏈;這過程能以DNA復(fù)制的滾環(huán)模型來說明。
上面提到帶有F因子的大腸桿菌有F+和Hfr二類,實(shí)際上并不是所有的Hfr全是相當(dāng)穩(wěn)定的,在許多Hfr群體中含有回復(fù)子,在這些回復(fù)子中F因子不再整合在染色體上,而回復(fù)到游離狀態(tài),當(dāng)F因子脫離寄主染色體時攜帶了細(xì)菌的基因,例如lac和gal等,這稱之為F′因子。帶有F′因子的菌稱為F′菌株。F′菌株也能與F-雜交,現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的研究工作。
五、實(shí)驗(yàn)步驟
1.菌液制備:
(1)實(shí)驗(yàn)前14—16小時,從冰箱保存的斜面菌種,挑少量菌于盛有5毫升完全液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中;每一個菌株接種一瓶,共接種4瓶,置37℃培養(yǎng)過夜。
(2)取出培養(yǎng)過夜的細(xì)菌,在W1177一瓶菌液中加入5毫升新鮮的完全培養(yǎng)液,充分搖勻,等量分成2瓶;其余3瓶菌液分別用滅菌的5毫升吸管,各吸出2.5毫升菌液,然后再各加入2.5毫升新鮮的完全培養(yǎng)液,充分搖勻,各菌于37℃繼續(xù)培養(yǎng)3—5小時。
(3)自溫箱取出三角燒瓶,分別倒入離心管,菌株W1177倒二支離心管,其余菌株各倒入一支離心管,離心沉淀,3,500轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘。
(4)倒去上清液,打勻沉淀,加入無菌水,離心洗滌3次,再加無菌水到原體積。
2.雜交——混合培養(yǎng):
(1)取12支滅菌試管,每支吸入3毫升經(jīng)融化的半固體培養(yǎng)基,并保溫在45℃(保溫溫度不宜高,北方氣溫低,可降低半固體中的瓊脂量)。
(2)12支試管分成三個雜交組合,即W1177×K12pro;W1177×W1485;W1177×HfrC。每個組合各4支試管,其中2支對照,2支混合菌液。
(3)對照組試管各吸F+或Hfr供體菌菌液1毫升,其余按雜交組合各吸供體菌和受體菌菌液0.5毫升,充分混勻。
(4)將各試管中含菌的半固體倒在有Vogel培養(yǎng)基底層的平板上,搖勻待凝,放37℃培養(yǎng),48小時后觀察(圖12-3)。
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

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