摘要 隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不論對(duì)酶分子本身作用機(jī)制的研究以及其他研究，越來(lái)越需要純度很高的酶制劑，這就要求我們熟悉酶提純的一般操作及酶的提純及活力測(cè)定等重要的生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)，本次實(shí)驗(yàn)主要是提取啤酒酵母中的蔗糖酶并測(cè)定其Km。在試驗(yàn)過(guò)程中用乙醇分級(jí)沉淀法，DEAE-Cellulose柱層析，分子篩層析提取純化蔗糖酶。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，雖然我們很努力,但由于我們對(duì)實(shí)驗(yàn)的程序不熟悉，因此在實(shí)驗(yàn)的一些過(guò)程中有一些明顯的操作失誤，使得實(shí)驗(yàn)的*后測(cè)定結(jié)果與理論值有一定出入。
關(guān)鍵詞 蔗糖酶 透析 Km
前言
生物體內(nèi)所發(fā)生的一切化學(xué)反應(yīng)，幾乎都是在專一性酶的催化下進(jìn)行的，因此酶的研究對(duì)了解生命活動(dòng)的規(guī)律以及生命本質(zhì)的闡述具有十分重要的意義。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不論對(duì)酶分子本身作用機(jī)制的研究以及其他研究，越來(lái)越需要純度高的酶制劑。由于酶本身也是蛋白質(zhì)，因此酶分離提存的方法大體上與蛋白質(zhì)純化方法相同，一般來(lái)說(shuō)，沒(méi)有一種固定的方法，而往往根據(jù)你所要分離提純酶的取材以及酶本身的物理﹑化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)來(lái)確定分離提純方法。各種酶的純化通常有五個(gè)階段：①材料的選擇與預(yù)處理；②細(xì)胞破碎；③抽提；④純化；⑤濃縮﹑干燥及保存。
酶分離純化成功與否的重要標(biāo)志，一是要有較高的收率，二是達(dá)到所要求的純度，這兩個(gè)指標(biāo)通常是矛盾的，可根據(jù)需要來(lái)有所側(cè)重，一般來(lái)說(shuō)，好的方法與步驟應(yīng)該是簡(jiǎn)單易行，*終的酶制劑有較高的收率和純度。
在分離提純過(guò)程中，應(yīng)該盡量避免引起蛋白質(zhì)變性的各種因素，此外，在分離提純前，必須建立對(duì)酶的分析鑒定方法，以正確指導(dǎo)分離提純地進(jìn)行。
材料與方法
1 實(shí)驗(yàn)儀器
冰箱，低速離心機(jī)，電泳儀，722分光光度計(jì)，托盤天平，水浴堝，血糖管，透析袋，水平電泳槽，微量加樣器，離心管，三角瓶，玻璃棒，滴管，燒杯，移液管，量筒，試管等。
2 實(shí)驗(yàn)試劑
乙酸鈉，甲苯，蒸餾水，10%乙酸,95%乙醇,0.2%Glc,溶液，3,5二硝基水楊酸試劑�？捡R斯亮藍(lán)G-250，牛血清白蛋白，2M NaOH,0.1M蔗糖。
3 試驗(yàn)方法
3.1葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：
取11支編號(hào)的試管按下表的順序加入0.2%Glc，水及3,5-二硝基水楊酸試劑。然后在沸水浴中加熱5分鐘，然后立即用自來(lái)水冷卻，轉(zhuǎn)移至血糖管中并用蒸餾水定容至25ml，搖勻，于540nm測(cè)光密度，結(jié)果如下表所示：
管號(hào)        含糖量（ug）
BG濃度        0.2%Glc
標(biāo)準(zhǔn)液（ml）        水（ml）        3，5-二硝基
水楊酸試劑（ml）        OD540nm
1        0.0        0.0        2.0        1.5        0.0
2        0.4        0.2        1.8        1.5        0.062
3        0.8        0.4        1.6        1.5        0.137
4        1.2        0.6        1.4        1.5        0.223
5        1.6        0.8        1.2        1.5        0.300
6        2.0        1.0        1.0        1.5        0.385
7        2.4        1.2        0.8        1.5        0.468
8        2.8        1.4        0.6        1.5        0.509
9        3.2        1.6        0.4        1.5        0.597
10        3.6        1.8        0.2        1.5        0.675
11        4.0        2.0        0.0        1.5        0.753
3.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的制作
取11支編號(hào)的試管，分別準(zhǔn)確加入如下表所示的牛血清白蛋白溶液，然后分別加入1.5ml考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白染色試劑，搖勻，放置3min后，在595nm比色讀取OD值，結(jié)果如下表所示：
管號(hào)        標(biāo)注蛋白濃度（ug/ml）        牛血清蛋白標(biāo)
準(zhǔn)液（ml）        水（ml）        考馬斯亮藍(lán)G-250
蛋白染色試劑（ml）        OD595
0        0        0        1.0        1.5        0
1        20        0.1        0.9        1.5        0.025
2        40        0.2        0.8        1.5        0.066
3        60        0.3        0.7        1.5        0.243
4        80        0.4        0.6        1.5        0.368
5        100        0.5        0.5        1.5        0.468
6        120        0.6        0.4        1.5        0.530
7        140        0.7        0.3        1.5        0.650
8        160        0.8        0.2        1.5        0.699
9        180        0.9        0.1        1.5        0.823
10        200        1.0        0.0        1.5        0.947
3.3轉(zhuǎn)化酶的純化
3.3.1粗品的制備和乙醇分級(jí)沉淀
3.3.1.1自溶
用臺(tái)秤稱取40g的新鮮啤酒酵母放在250毫升三角瓶中，再分別放入1.2克乙酸鈉細(xì)粉末、20毫升甲苯。然后在35℃水浴中間隔片刻震蕩、保溫30分鐘，此時(shí)會(huì)觀察到菌體自溶現(xiàn)象。
3.3.3.2抽提及粗酶的制備
往上述自溶液中加入60毫升水，于35℃保溫過(guò)夜。第二天，將自溶液于4000RPM*15min離心。取出離心管后分三層：下層透明，中間為蛋白層，上層為有機(jī)層。用吸液管將*上層的甲苯吸去，然后可再用一藥勺擋住塊狀粘稠物，傾斜離心管倒出上清液。棄去粘稠物。此時(shí)會(huì)有一些懸浮物存在。再離心一次（4000RPM*20min），如上清液已濾清，小心倒入250毫升燒杯中。得到的溶液就是無(wú)細(xì)胞抽提液即粗酶液。
量出粗酶液的體積VE1=42ml，從中取出1毫升置0—4℃保存，將待測(cè)酶活力和蛋白濃度。
3.3.3.3乙醇分級(jí)沉淀
先用10%的乙酸調(diào)粗酶液pH在4.4—4.6之間，記錄加入10%乙酸的體積。
⑴ 32%乙醇飽和度
按下列的公式算出使粗酶液的乙醇濃度達(dá)到32%時(shí)所需乙醇體積。
X1/V+X1=0.32
其中V=44ml，需要加入95%的乙醇體積：X/0.95=22ml
注意：在滴加乙醇時(shí)滴與滴之間不能連成線 。
滴加結(jié)束后，于4000RPM*5min。上清轉(zhuǎn)移到另一燒杯中待用，棄去沉淀。
⑵47.5%的乙醇飽和度
按下式算出使酶液乙醇濃度達(dá)到47.5%時(shí)所需乙醇的量。
X2/V=X2=0.475
需要加入95%的乙醇體積X2/0.95=44ml
按下式算出使酶液乙醇濃度達(dá)到47.5%所需補(bǔ)加的乙醇的體積。
X2/0.95-X1/0.95=22ml
然后靜置10min，于4000RPM*10min，棄去上清會(huì)得少量沉淀。將沉淀用10ml，pH6.0，0.005MPBS溶解（10mlPBS應(yīng)分2-3次充分溶解），裝入自制的透析袋中，并作一標(biāo)記，將透析袋放入盛有pH6.0，0.005MPBS的燒杯中進(jìn)行透析，時(shí)間為2-3小時(shí)（中間要換一次透析液，并置冰箱中進(jìn)行透析）。透析后將透析酶液離心，4000RPM*5min，取上清，量體積即為E2并留1ml（0-4℃保存）待測(cè)酶活力及蛋白濃度，其余酶液上DEAE-Cellulose柱。
3.3.2次純化
3.3.2.1裝柱
本實(shí)驗(yàn)使用的層析柱的規(guī)格是1.5cm（內(nèi)徑）*20cm（高）。把柱子垂直固定好。將DEAE-Cellulose裝柱，床高距柱頂2cm為宜。用起始緩沖液（pH6.0,0.005M PBS），平衡流速成4ml/5min。
3.4.2.2柱的平衡
裝好柱后，用起始緩沖液（pH6.0,0.005M PBS），平衡流速成4ml/5min。目的是交換劑上的平衡離子全部變成起始緩沖液的相應(yīng)離子。另一方面，在流洗柱的過(guò)程中，也可以使交換劑床緊密，從而提高分離效果。平衡洗柱的流出體積至少應(yīng)是床體積的5倍左右。
3.3.2.3上樣
將柱中多余液體放出后，將2ml樣品小心加到層析柱中，打開(kāi)流速夾，使樣品液流入柱內(nèi)。然后加pH6.0,0.005M PBS150ml洗柱。此流出液理論上應(yīng)不含我們所需要的酶，因此可不必收集，但必須檢查是否有酶活力存在。
3.3.2.4洗脫
待150ml PBS洗完后，改換含0.1M NaCl的pH6.0,0.005M PBS洗脫（此處洗下來(lái)的是我們所需的酶），流速為0.6-0.8ml/min，每管收集5ml，收集5-7管后，改換含0.2 M NaCl的pH6.0,0.005M PBS洗脫，收集至經(jīng)檢查無(wú)酶活力為止。
3.3.2.5酶活力的檢測(cè)
取試管若干支，編號(hào)，各加入2ml5%蔗糖（pH4.6）每間隔一管取0.05ml收集液，按先后順序分別加入上述含2ml5%蔗糖的試管中混勻，置35℃水浴10min仍以先后順序加入0.5ml 1M NaOH,立即搖勻，加入1.5ml3，5—二硝基水楊酸，于沸水浴中煮沸5min，用自來(lái)水冷卻，轉(zhuǎn)移至血糖管中，用蒸餾水稀釋至25ml，塞好，搖勻。直接目測(cè)，即可確定活力高峰范圍。合并活力高峰酶液，量體積，即得E3，從中取出1毫升置0—4℃保存，將待測(cè)酶活力和蛋白濃度。將其余的酶液裝入透析袋中，作一標(biāo)記用pH6.0,0.005M PBS透析3小時(shí)（置冰箱），然后用聚乙二醇6000（PEG）將酶液濃縮至1—1.5ml，供下步用。
3.3.3第二次純化：分子篩層析
3.3.3.1裝柱
取已經(jīng)與處理好的G-150適量，裝入自制的1*25cm的層析柱中，用pH6.0,0.005M PBS平衡，流速1ml/5min,流出液體積大約為柱床體積5倍左右視為平衡好。
3.5.2上樣
與一般柱層析相同，將柱中多余液體放出后，將樣品小心加到凝膠柱上，打開(kāi)流速夾，使樣品流入柱內(nèi)。然后加pH6.0,0.005M PBS150ml洗脫，檢測(cè)酶活力，確定活力高峰位置，收集活力高峰范圍內(nèi)的酶液，量體積，即為E4。留1ml于4℃保存作為 測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和酶活力用。其余用于電泳法檢測(cè)酶純度和測(cè)定米氏常數(shù)Km用。
3.4轉(zhuǎn)化酶活力及蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定
1活力測(cè)定
酶液稀釋：將E1﹑E2﹑E3﹑E4依次稀釋40﹑160﹑400﹑400倍；
2反應(yīng)：取4支試管分別加入2ml稀釋的酶液（每個(gè)樣品平行作3份），一個(gè)空白對(duì)照加0.5 ml1 M NaOH，搖勻，使酶失活；另3支為測(cè)定管。再分別加入2ml5%的蔗糖，并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10min，分別加入0.5 ml1 M NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。從反映混合液中取出0.5 ml于血糖管中，加1.5ml3，5—二硝基水楊酸和1.5ml蒸餾水，混勻，于沸水浴中加熱5 min，定容至25ml搖勻，在540nm下測(cè)定吸光度。
3.5蔗糖酶米氏常數(shù)—Km的測(cè)定
3.5.1取11支試管，編號(hào)，按下表將蔗糖液，乙酸緩沖液分別加入各管中；
3.5.2于各管依次間隔2min加入酶液2ml，記時(shí)，立即搖勻，于室溫下靜置10min；
3.5.3按同樣順序和時(shí)間間隔加入0.5 ml1 M NaOH，搖勻終止反應(yīng)；
3.5.4吸取反應(yīng)液0.5ml，加入已含有3,5-二硝基水楊酸和1.5ml蒸餾水的試管中搖勻，于沸水浴加熱5min，冷卻后于血糖管中定容至25ml，搖勻，在540nm測(cè)定值OD。Km的測(cè)定：


管號(hào)        0.1M蔗糖（ml）        乙酸緩沖液（ml）        酶液（ml）        2M NaOH（ml）        吸取反應(yīng)液（ml）        3，5-二硝基水楊酸 （ml）        蒸餾水（ml）        [S]        1/[S]
（1/M）        1/V
（1/OD）
1        0        2.00        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0                0
2        0.20        1.80        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.005        200        5.464
3        0.25        1.75        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.000625        160        4.367
4        0.30        1.70        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0075        133.8        3.571
5        0.35        1.65        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.00875        114.8        3.247
6        0.40        1.60        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5                100        2.701
7        0.50        1.50        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0125        80        2.222
8        0.60        1.40        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.015        66.7        1.992
9        0.80        1.20        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.02        50        1.484
10        1.00        1.00        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.025        40        1.238
11        1.50        0.50        2.0        0.5        0.5        1.5        1.5        0.0375        26.7        1.045

結(jié)果與分析
4.1根據(jù)圖表的數(shù)據(jù)可以得到下面的曲線，根據(jù)本曲線為后面酶活力的測(cè)定提供參考。得到公式y(tǒng)=0.1895x-0.0054

4.2根據(jù)得到的蛋白曲線得到如下公式：y=0.0049x-0.0529

4.4在540nm下測(cè)定吸光度結(jié)果如下:
酶        OD540        平均值
E1*40        0.623        0.679        0.720        0.674
E2*160        0.528                        0.528
E3*400        0.269        0.518（舍掉）        0.271        0.270
E4*400        0.293        0.234        0.299        0.275
在測(cè)定的時(shí)候，由于E2的量不足，因此沒(méi)能完成3組的測(cè)定，由于數(shù)據(jù)比較單調(diào)，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性比較低；測(cè)定E3時(shí)，第二組數(shù)據(jù)與另外兩個(gè)出入很明顯，可能是操作中酶液量取不準(zhǔn)確或者試管洗刷不徹底，因此舍棄這個(gè)數(shù)據(jù)。
在595nm的吸光度結(jié)果如下
酶        OD595
E*40        0.522
E*40        0.240
E*4        0.380
E*5        0.135

跟去上圖得到公式:y=0.0258+0.0229
橫軸截距=-1/Km
得到Km=0.1127，而Km的理論值是25~28mM，所得結(jié)果明顯大于理論值，估計(jì)主要原因可能是提取過(guò)程中由于沒(méi)有嚴(yán)格在低溫下操作和在離心時(shí)由于多個(gè)小組連續(xù)使用離心機(jī)，使得離心機(jī)的溫度升高等多種原因，導(dǎo)致酶活降低。
4.5數(shù)據(jù)處理與分析
步驟        樣品總體積（ml）        酶活力（u/ml）        總活力（u）        蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）        總蛋白質(zhì)量（mg）        比活力（u/mgPr）        提純倍數(shù)（fold）        階段收率（%）        總收率（%）
E1        42        358.5        15057        4410        185220        0.08129        1        100        100
E2        7.5        1126        8445        2400        18000        0.4692        10        56        56
E3        5        1452        7260        352        1760        4.125        105        86        48
E4        1.7        1482.5        2520        143        242        10.36        765        35        17
我們經(jīng)過(guò)多步操作提取到了達(dá)到較高純度的蔗糖酶。由于實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜，且不是連續(xù)操作，而是中間有很多間斷等多種因素的影響，以致所得數(shù)據(jù)不太理想。由于本實(shí)驗(yàn)的銜接性比較強(qiáng)，隨著實(shí)驗(yàn)的深入，試驗(yàn)的偏差就愈來(lái)愈明顯，因而后面數(shù)據(jù)較難取舍，只能得出十分粗糙的結(jié)論，因而可信度也隨之降低。其中E1，E2是試驗(yàn)的初始步驟，相對(duì)可信度比較高；另外盡管E3，E4蛋白濃度差別比較大，但酶活力基本相同，酶活力沒(méi)有上升，沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的目的。酶的總收率達(dá)17%，基本達(dá)到預(yù)期目的。另外，由于時(shí)間倉(cāng)促和操作水平的限制，本實(shí)驗(yàn)也有許多不足之處需要改進(jìn)。
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