主營產品：

ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，大鼠ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，裸鼠ELISA試劑盒，倉鼠ELISA試劑盒，標準品，培養(yǎng)基和生物試劑等

聯(lián)系我們/CONTACT US

聯(lián)系人：錢經理

電話：18221656311

手機：18221656311

地址：上海市松江臨港科技城漢橋文化科技園B座

郵編：200093

傳真：021-64881400

郵箱：2885617636@qq.com

阿儀網商鋪：http://www.app17.com/c58469/

手機網站：m.hybiosh.com

產品分類/CLASS

技術文章ARTICLE

技術欄:磷酸化蛋白WB實驗注意事項

點擊次數：9681 發(fā)布時間：2024/4/28 10:06:51

蛋白磷酸化是一種非常重要的翻譯后加工，做信號通路必然是要檢測蛋白磷酸化的，Western blot是評估蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法，其實和跑正常蛋白沒什么出入，只不過孵育的是識別磷酸化的抗體。下面恒遠生物帶大家總結一下實驗中的注意要點。

一、關于磷酸化蛋白樣品

裂解液問題蛋白的磷酸化是一個非常迅速的反應，取樣品的過程要迅速，樣品要新鮮，樣品處理要在冰上操作，操作時間盡量短。用PBS洗滌細胞時，PBS一定要4℃預冷。如果是組織的話，提取蛋白時采用液氮研磨的方法，研磨器具要提預冷，保持低溫的狀態(tài)。

提取磷酸化蛋白的裂解液新鮮配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則即使條帶壓出來也會很淺，結果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制劑。再者，還要看你檢測的蛋白磷酸化位點是什么氨基酸，如果是酪氨酸還要加1 u M的sodium vanidate即原釩酸鈉，上樣不要煮沸，煮沸可能會破壞其磷酸化位點。

二、關于WB時背景和條帶的問題

磷酸化蛋白WB時背景也往往較深，所以壓片時間要適當，不能太長或過短，太長則背景太深蓋住想要的那條帶，時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。做磷酸化蛋白WB時，除了目標蛋白的條帶以外，往往會出現非特異性的條帶。磷酸化抗體不好的話，甚至會壓出非特異性的條帶，反而沒有你想要的條帶，所以壓片后，一定要根據Markers比對一下你壓出的條帶分子量是否正確。

三、關于蛋白總的表達量問題

研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法，一是：相同的樣品在不同的孔中上樣兩次（可在相同的膠上，也可在不同的膠上），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個膠，壓內標。但是一般不建議如此做，因為這樣比較時誤差還是較大的。因此，比較公認的，也是常用的方法，即用strip液將原先結合上的磷酸化抗體及二抗洗去，然后用同一張膜壓總蛋白。然后再洗脫一次，再壓內標。

更多實驗資訊可咨詢我司業(yè)務員。上海恒遠生物科技有限公司擁有自己的實驗室，備有業(yè)的技術研發(fā)團隊，對于各種生物試劑，細胞，血清，ELISA試劑盒的研發(fā)與銷售，實驗提供免費代測服務，并提供精湛的技術服務，如果您有實驗上的問題歡迎來咨詢，為您提供業(yè)的一對一技術指導。

原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司