主營(yíng)產(chǎn)品：

ELISA試劑盒，人ELISA試劑盒，大鼠ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒，裸鼠ELISA試劑盒，倉(cāng)鼠ELISA試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)品，培養(yǎng)基和生物試劑等

聯(lián)系我們/CONTACT US

聯(lián)系人：錢經(jīng)理

電話：18221656311

手機(jī)：18221656311

地址：上海市松江臨港科技城漢橋文化科技園B座

郵編：200093

傳真：021-64881400

郵箱：2885617636@qq.com

阿儀網(wǎng)商鋪：http://www.app17.com/c58469/

手機(jī)網(wǎng)站：m.hybiosh.com

產(chǎn)品分類/CLASS

技術(shù)文章ARTICLE

上海恒遠(yuǎn)為您解讀細(xì)胞之裂解方法

點(diǎn)擊次數(shù)：13680 發(fā)布時(shí)間：2018/8/9 9:45:09

對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞樣品：
1. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的*終濃度為1mM。
2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會(huì)被裂解。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成50-100萬(wàn)細(xì)胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
裂解液用量說(shuō)明：通常6孔板每孔細(xì)胞加入150微升裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200微升或250微升。
在試驗(yàn)中，不同的細(xì)胞采用不同的裂解方法。如研磨，細(xì)胞勻漿，TritonX－－100，稀減法等等。那么，具體該怎樣選擇細(xì)胞的裂解方法？本節(jié)內(nèi)容主要圍繞組織樣本裂解細(xì)胞的方法做詳細(xì)介紹。具體操作方法流程如下，也歡迎廣大新老客戶提供寶貴建議參與我司探討交流。
1. 把組織剪切成細(xì)小的碎片。
2. 融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的*終濃度為1mM。
3. 按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。)
4. 用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
5. 充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
6. 如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過(guò)強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

注：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正�，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。
上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司主營(yíng)：elisa試劑盒,人Elisa試劑盒,大鼠Elisa試劑盒,小鼠Elisa試劑盒,生物試劑,血清,抗體,培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)品,國(guó)產(chǎn)血清、GIBCO胎牛血清等。種屬齊全，價(jià)格優(yōu)惠。期待您的來(lái)電咨詢與合作！

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司