一、怎么選擇合適的對照？

   1）同型對照：使用同型抗體做平行實驗，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結合。

   2）陰性細胞對照：使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實驗，主要目的是消除抗體的非特異性結合。

   3）二抗對照：第二抗體多為熒光標記的多抗，非特異性結合一般較高，可能造成基礎熒光值偏高，設立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。

   4）陽性對照：一般會使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實驗，主要目的是排除實驗中實驗方法、試劑、操作等實驗的影響因素。

   5）空白對照：不進行任何標記的細胞，主要目的是用于測定基礎熒光信號表達值。

   二、收集的細胞通過流式儀檢測時，一般多少的細胞量合適？

   進行流式檢測時，至少需要記錄5000個活細胞，一般調整細胞密度至1*106/100ul進行流式檢測。

   三、FCM檢測過程中如何設門（gating）？

   一般根據散射光進行設門，即我們通常所說的散（forward scatter, FSC）和側散（side scatter, SSC）來設門。FSC的大小與細胞的直徑成正相關，不同的細胞，細胞越大，其FSC越大；反之越小。SSC的大小與細胞內顆粒結構的質量成正相關，不同的細胞，細胞內顆粒結構越復雜，質量越大，其SSC越大；反之越小。

   四、FCM檢測過程中如何調節(jié)補償？

   在FCM檢測過程中，如果存在多色，則必須進行熒光補償調節(jié)。調節(jié)補償先要知道雙陰性細胞的情況，其次，必須要用單陽和雙陰性細胞。只有在有陰性細胞作為參照的情況下，才能既不會過多又不會過少地調節(jié)補償。

   五、FCM檢測時，每次實驗的細胞數一定要相同嗎？

   FCM檢測時，若不進行細胞計數而憑感覺隨意進行實驗會直接影響實驗結果。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少。由此可見，不同的細胞量會影響終的實驗結果。因此，在準備樣本時，必須進行細胞計數，使每個分組及每次實驗的細胞數保持一致。

   六、FCM檢測時，如果存在多色分析，應該如何進行配色呢？

   在FCM檢測過程中，如果存在多色分析，雖然可以通過熒光補償來消除熒光光譜重疊的影響。但調節(jié)補償過大在一定程度上仍然會影響測值的準確性，因此，我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。

原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司